Mikromanipulation von Embryonen und Eizellen

 

Dr. Andrea Lucas-Hahn
Institut für Tierzucht und Tierverhalten (FAL) Mariensee
Forschungsbereich Biotechnologie
31535 Neustadt

Unter Mikromanipulation versteht man den Eingriff an Embryonen und Eizellen unter mikroskopischer Kontrolle zur Veränderung ihrer Struktur bzw. Funktion. Dies wird mit Hilfe von sogenannten Mikromanipulatoren d.h. Geräte, die relativ ungelenke Handbewegungen unter dem Mikroskop in fein dosierte Bewegungen umsetzen, durchgeführt. An den Mikromanipulatoren werden die Mikroinstrumente befestigt, die je nach Eingriff sehr unterschiedlich sein können und aus Glaskapillaren an einer Mikroschmiede meist selbst hergestellt werden. Es gibt jedoch auch Firmen, die sich auf die Produktion von Mikroinstrumenten für die Mikromanipulation spezialisiert haben. Ihre Produkte werden ganz nach Wunsch des Versuchsanstellers standardisiert angefertigt, steril verpackt und verschickt.

 
 

Abb. 1: Mikromanipulationseinheit bestehend aus einem Mikroskop und zwei Mikromanipulatoren.

   
  Im folgenden werden die wichtigsten praxisorientierten Mikromanipulationsverfahren erläutert.
   
 

Teilung von Embryonen

Seit Mitte der 80er Jahre wird das Splitting beim Rind routinemäßig im kommerziellen Embryo Transfer zur theoretischen Verdopplung transferierbarer Embryonen von einem wertvollen Spendertier eingesetzt. Das Verfahren der Teilung hat sich im Laufe der Jahre vereinfacht und kann heutzutage von (fast) jedem erfahrenen Techniker vor Ort, d.h. im Stall oder sogar in der Küche an einem stabilen Tisch, durchgeführt werden. Unblutig gespülte Rinderembryonen werden mit einer mobilen Mikromanipulationseinheit, bestehend aus einem Stereomikroskop und 1-2 Manipulatoren, geteilt, dabei ist an einem Mikromanipulator eine Mikroklinge, wie sie in der Augenchirurgie verwendet wird, befestigt. Die Teilung des Embryos erfolgt durch Absenken der Klinge gegen den Boden der Petrischale. Das Wegrutschen des Embryos wird entweder durch eine an dem zweiten Manipulator befindliche Haltepipette oder in der Version mit einem Manipulator durch fein gezogene Vertiefungen im Boden der Petrischale verhindert. Überträgt man die so entstandenen Hälften auf Empfängertiere werden Trächtigkeitsraten von 75% bei einer Zwillingsrate von 25 - 30% erzielt. Dies ist bezogen auf die Raten mit intakten Embryonen (70-80% Trächtigkeitsrate) eine Steigerung von 25%.

Embryonenbiopsie

Die Biopsie früher Embryonalstadien erfolgt hauptsächlich zum Zwecke der Geschlechtsbestimmung. Die Entnahme weniger Zellen aus einem Embryo kann entweder durch Schneide- oder Quetschverfahren erfolgen. Bei Blastozysten wird mit dem Mikromesser eine ungleiche Teilung vorgenommen, wobei lediglich ein Teil des Trophektoderms (bildet später u.a. die Plazenta) abgeschnitten wird, während die ICM (aus der sich später der Fetus entwickelt) unversehrt bleibt. Bei Morulastadien hat sich die Quetschtechnik, bei der die Zona pellucida mit einer Glasnadel punktiert wird und durch den Schlitz mit einer Pipette wenige Zellen herausgedrückt werden, als günstiger erwiesen. Für die Geschlechtsbestimmung wird von dem Bioptat die DNA extrahiert, mittels PCR vervielfältigt und so auf das Vorhandensein Y-Chromsomen-spezifischer Sequenzen untersucht. Grundvoraussetzung für optimale (aussagesichere) Ergebnisse ist hier eine äußerst sorgfältige Vorgehensweise, um etwaige Kontaminationen zu vermeiden, und ein gut funktionierendes molekularbiologisches Labor.

   
 
 

Abbildung 2:
Gelelektrophoretische Darstellung der PCR-Produkte zur Geschlechtsbestimmung bei Rinderembryonen. Bei männlichen Embryonen (XY) werden zwei Banden sichtbar, bei weiblichen Embryonen hingegen (XX) nur eine Bande.

Klonen (Kerntransfer)

Spätestens seit der Geburt von Dolly (1996) ist das Verfahren des Kerntransfers mit seinen vielfältigen Einsatzmöglichkeiten in der Tierzucht, Grundlagenforschung und Biotechnologie bekannt. Insbesondere bei der Erzeugung transgener Nutztiere wird dieser Technik eine große Zukunft versprochen, da die Integration des Fremdgens zielgerichtet erfolgen kann. Das Klonen ist das anspruchsvollste Mikromanipulationsverfahren mit einer Vielzahl von Einzelschritten im Bereich der Mikromanipulation und der In vitro-Produktion von Embryonen. Zuerst wird bei der Entkernung (Enukleation) das genetische Material (Zellkern und Polkörper) einer gereiften Eizelle entfernt. Dazu wird das Zellplasma mit einer chemischen Substanz aufgeweicht. Dann wird die Oozyte an einer Haltepipette fixiert und der Polkörper mitsamt ihn umgebendes Zellplasma mit einer angeschliffenen Enukleationspipette abgesaugt. Durch Anfärben der DNA mit einem Fluoreszenzfarbstoff kann der Erfolg der Entkernung kontrolliert werden. Im zweiten Schritt erfolgt der Kerntransfer, bei dem eine vereinzelte Zelle aus einer Zellkultur in die entkernte Eizelle transferiert wird. Die Spenderzellen können von Embryonen.

Feten oder von erwachsenen Tieren stammen. Anschließend werden Spender- und Empfängerzelle durch Anlegen eines elektrischen Feldes fusioniert. Der so „rekonstruierte Embryo“ wird dann künstlich aktiviert, um den Zellkern der Spenderzelle in das Stadium der frisch befruchteten Eizelle zurück zu versetzen (Reprogrammierung). Die geklonten Embryonen entwickeln sich in einer 7-tägigen In vitro-Kultur bis zur Blastozyste weiter. Nach Transfer dieser Embryonen auf Empfängertiere werden Trächtigkeiten etabliert, wobei jedoch bei etwa 50% der Trächtigkeiten mit Kerntransferembryonen Probleme wie Aborte bis ins letzte Trächtigkeitsdrittel, Plazentationsstörungen, Hydroallantois, Missbildungen und übergroße Kälber (Large Offspring Syndrome) beobachtet werden. Ursächlich dafür wird eine abnormale Expression entwicklungsrelevanter Gene als Folge einer fehlerhaften Reprogrammierung diskutiert. Aktuelle Forschungsarbeiten beschäftigen sich mit der Enträtselung dieses Phänomens.

Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)

Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion ist eine modifizierte Art der In vitro-Befruchtung, bei der ein einzelnes Spermium zur Befruchtung direkt in das Zytoplasma einer gereiften Eizelle injiziert wird. In der Humanmedizin wurde diese Technik zur Therapie männlicher Sub- oder Infertilität entwickelt. In der Tierzucht wird diese Methode beispielsweise bei der Erhaltung bedrohter Tierarten, bei denen nur unzureichende Samenmengen mit schlechter Qualität zur Verfügung stehen, eingesetzt. ICSI ist auch interessant beim Einsatz flowzytometrisch geschlechtssortierter Spermien, wo z.B. für das Schwein die Menge gesorteter Spermien für eine normale Besamung noch nicht ausreicht und die „normale“ In-vitro Befruchtung aufgrund hoher Polyspermieraten nur eingeschränkt genutzt werden kann. Für eine erfolgreiche Durchführung der ICSI ist der Durchmesser der Injektionspipette außerordentlich wichtig. Sie muss der Spermienkopfgröße der jeweiligen Tierart optimal angepasst sein und kann von Spezies zu Spezies um mehrere µm differieren. Die Spermien werden in einer hochviskösen Lösung immobilisiert und mit dem Spermienschwanz zuerst in die Injektionspipette eingezogen. Dann erfolgt die Injektion in eine gereifte Eizelle, wobei durch leichten Unterdruck Zytoplasma in die Pipette gesogen wird, um sicherzustellen, dass die Zellmembran durchstoßen wurde und das Spermium sicher positioniert werden kann. Mit diesem Verfahren wurden in Mariensee die weltweit ersten Ferkel aus ICSI mit geschlechtsspezifisch sortiertem Sperma geboren. Für die Spermieninjektionen wurden nur die Y-Chromosom-tragenden Spermien verwendet. Alle dreizehn Ferkel waren dieser Prognose entsprechend männlich

   
 
 

Abbildung 3: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion in eine gereifte Schweineeizelle (Foto:S. Probst)

Zusammenfassende Betrachtung

Neben dem Vorteil der Effizienzsteigerung durch Erstellung identischer/transgener Nachkommen bzw. von Nachkommen mit gezieltem Geschlecht müssen für die Mikromanipulation auch Einschränkungen gemacht werden. Dies ist zum einen die Kostenfrage für Laborausstattung (Mikromanipulatoren, gutes Mikroskop mit großer Vergrößerung, begasbarer Brutschrank) und Ausbildung des Personals. Zum anderen stellt die verletzte Zona pellucida ein seuchenhygienisches Risiko dar, das den Export mikromanipulierter Embryonen erschwert bzw. nicht erlaubt. Weiterhin ist bekannt, dass standardisierte Kryokonservierungsverfahren nur eingeschränkt für mikromanipulierte Embryonen eingesetzt werden können und somit der Anteil an Frischtransfers zunimmt. Hier muss durch den Anwender eine Kosten-Nutzen-Abschätzung erfolgen. Realistisch betrachtet, können aufwendige Verfahren wie beispielsweise das Klonen, nur in großen Forschungseinrichtungen mit entsprechender Personal- und Laborausstattung erfolgreich durchgeführt werden.

Stand: August 2003